3 de noviembre de 2012

Resultados

Resultados de los Laboratorios
A lo largo de este año se han realizado 5 laboratorios, de los cuales se han obtenido varios resultados, y variedad de aspectos por mejorar. Estos son:
Laboratorio 1: 18 de Abril
En este laboratorio hicimos uso de esquejes tomados directamente de la flor (como materia prima), y la adición de un Suplemento vitamínico (Abono),

En esta práctica no se ve ningún tipo de avance, por lo que optamos por no volver a hacer uso de los esquejes tomados directamente de la flor por su aparente contaminación (y así mismo porque su desinfección pudo haber causado una posible deshidratación de los esquejes). (Fotos 6 y 7)

Fotos 6 y 7
Laboratorio 1

Laboratorio 2: 11 de Mayo
Debido a los resultados obtenidos en el laboratorio anterior, optamos por hacer uso de las semillas de girasol comerciales, y la aplicación de una Hormona de crecimiento y un Suplemento Vitamínico al agar.
Con este laboratorio nos vemos en la necesidad de realizar un nuevo cultivo, ya que de los doce (12) cultivos que se realizaron, sólo se vio avance en 2 tubos de ensayo, el resto de cultivos se contaminó. (Fotos 8 y 9 a, b, c y d).
Foto 8
 Foto 9 (a)
 Foto 9 (b)
 Foto 9 (c)
Foto 9 (d)

Laboratorio 3: 14 de Junio
Con base en los resultados obtenidos en el laboratorio anterior, optamos por generar un Cultivo para Control Experimental e identificar así cuál es el factor que afecta los resultados esperados.
A partir de este laboratorio, se determina que la mayoría de los cultivos se contamina por factores ambientales y por falencia en el protocolo de desinfección para las semillas. Así que se adoptan nuevos métodos o protocolos para la desinfección de las semillas, y accedemos a la construcción de una cámara de flujo laminar artesanal. (Fotos 10, 11, 12 y 13)

Foto 10
Foto 11
Foto 12
Foto 13
Laboratorio 4: 02 de Agosto
Con el fin de analizar la eficacia de los protocolos de desinfección en semillas que elegimos (entre ellos, los conocidos métodos DDF, DDS y Desinfección con Jabón), preparamos el Agar Nutritivo, y desinfectamos las semillas como lo proponen los métodos ya nombrados. Siendo J, Desinfección con Jabón (Foto 14); F, Desinfección Fuerte (Foto 15) y S, Desinfección Suave (Foto 16), y la comparación de los 3 métodos (Foto 17).
 Foto 14
Desinfección con Jabón
 Foto 15
Desinfección Fuerte
Foto 16
Desinfección Suave
 Foto 17
Comparación de los Métodos

Construcción de la Cámara de Flujo Laminar Artesanal

En cuanto a los resultados de las Pruebas de Eficiencia al comparar los resultados obtenidos en las cajas de Petri, vemos que la contaminación es mucho menor en la caja que está dentro de la Cámara de Flujo Laminar (Foto 18), como se observa a continuación…

Foto 18
Pruebas de Eficiencia de la cámara de Flujo Laminar.
La contaminación en la Caja 1, alcanza el 30% y la 2 el 100%.

Laboratorio 5: 17 de Octubre
Este laboratorio, fue la recopilación de todos los aspectos que se mejoraron en las prácticas anteriores, así que se hizo uso de la metodología antes nombrada, de los protocolos de desinfección ya estandarizados, y de la cámara de flujo laminar como zona de trabajo. Sembrando en ocho (8) tubos de ensayo, (2) dos con la concentración de la hormona al 0.5, otros 2 (dos) al 0.2, dos más al 1% y los últimos como grupo control (Foto 19).
A comparación del resto de los laboratorios, la contaminación fue mucho menor (Foto 20), y se deduce que la contaminación fue provocada por la hormona (Foto 21).
Foto 19
Cultivo Laboratorio 5
Foto 20
Grupo Control
Foto 21
Cultivo con Hormona

Construcción y Pruebas de Eficiencia de la Cámara de Flujo Laminar Artesanal

Construcción de la Cámara de Flujo Laminar

Con el fin de obtener una zona de trabajo libre de agentes contaminantes (hongos o bacterias), optamos por dar inicio a la construcción artesanal de una Cámara de Flujo Laminar (Fotos 2 y 3), esta nos generaría el estado aséptico que necesitamos para nuestras prácticas.
Para construir la cámara de Flujo Laminar, nos basamos en planos propuestos por Lotte & Thomas Orchids (tomados de: http://www.orchideenvermehrung.at/cgi-local/framebreaker/reload.pl?english/lfh/construction%20manual.htm el 28/08/12) y adaptados al proyecto haciendo uso de un filtro artesanal construido también en la institución, por compañeros del curso.
Fotos 2 y 3
Construcción de la Cámara de Flujo Laminar.
Pruebas de Eficiencia de la Cámara de Flujo Laminar
Para comprobar si la Cámara de Flujo Laminar cumplía con el fin propuesto, se sometió a una prueba de eficiencia:
Se dejaron abiertas dos cajas de Petri con Agar Nutritivo, una dentro de la cámara de Flujo Laminar (Foto 4), y la otra fuera de ella (Foto 5), ambas en medio de dos mecheros por 3 minutos, con el fin de analizar el nivel de contaminación de estas.
También se comprobó el potencial del extractor a través de los mecheros, pues era necesario que la llama de estos se inclinará 45º.
Foto 4
Prueba de Eficiencia Dentro de la CFL

Foto 5
Prueba de Eficiencia Fuera de la CFL

Estandarización del Protocolo de Siembra

Estandarización del Protocolo de Siembra


Para poder estandarizar el método de siembra, se llevaron a cabo 5 laboratorios haciendo uso de diferentes procedimientos, finalmente se concluyo que el más efectivo fue el siguiente:
Preparar el medio de cultivo (Agar Nutritivo).
Desinfectar las semillas de acuerdo al protocolo de Desinfección Suave (DS) y Desinfección Fuerte (DF). (que más adelante se describirá)
- Esterilizar el material (Tubos de Ensayo, Corchos, Agua Destilada y Medio de Cultivo) en la autoclave.
- Realizar diluciones de la hormona a concentraciones de, 1%, 2% y 5%.
- Dispensar en los 8 tubos de ensayo el medio de cultivo, 2 tubos para cada dilución y 2 tubos control sin la hormona.
- Sembrar las semillas en todos los medios de cultivo
- Sellar los tubos con los corchos y papel Vinipel.
- Colocar en un lugar donde tengan luz y estén a temperatura ambiente.
Protocolo de desinfección de las Semillas
Como se dijo anteriormente, con base a los resultados que obtuvimos en los laboratorios que llevamos a cabo, determinamos iniciar a estandarizar un protocolo de desinfección para las semillas (Foto 1), este es el método de la Doble Desinfección (DD).
En la doble desinfección (DD), el total de las semillas se sumergieron durante 1 minuto en etanol 70 % y luego se probaron 2 concentraciones de NaClO (1.2% y 0.8% de cloro activo) con 2 tiempos de exposición de las semillas (30 y 15 minutos, respectivamente). A la combinación de mayor concentración de NaClO y tiempo se la denominó “Desinfección Fuerte” (DF), a la otra se la llamó “Desinfección Suave” (DS). Luego, en ambos casos, las semillas se enjuagaron tres veces con agua estéril y se dejaron en el agua del último enjuague durante toda la noche para su imbibición.
Al día siguiente se realizó la segunda desinfección con NaClO (0.8% de cloro activo) durante 20 minutos para la desinfección fuerte y 15 minutos para la desinfección suave, seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril.
Foto 1.
Protocolo de desinfección de las semillas.

Definición Cámara de Flujo Laminar

Cámara de Flujo Laminar    




Una cámara de flujo laminar es una cabina en la que se emplea un extractor para forzar el paso del aire y todas las partículas que este contiene a través de un filtro HEPA y proporcionar aire limpio o estéril a la zona de trabajo.
Su función es mantener el área de trabajo libre de partículas, (estado aséptico) especialmente de posibles contaminantes (bacterias u hongos), que puedan acceder al cultivo vegetal. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas las partículas contaminantes.
Las cabinas de flujo laminar son utilizadas para estudios que requiera un ambiente limpio, o que necesiten un grado tal de pureza en el que no exista ningún agente contaminante, igualmente que ninguna partícula de la muestra afecte el medio ambiente del laboratorio.