Estandarización
del Protocolo de Siembra
Para poder
estandarizar el método de siembra, se llevaron a cabo 5 laboratorios haciendo
uso de diferentes procedimientos, finalmente se concluyo que el más efectivo
fue el siguiente:
Preparar el medio de cultivo (Agar Nutritivo).
Desinfectar las semillas de acuerdo al protocolo de
Desinfección Suave (DS) y Desinfección Fuerte (DF). (que más adelante se
describirá)
- Esterilizar el material (Tubos de Ensayo, Corchos, Agua Destilada y Medio
de Cultivo) en la autoclave.
- Realizar diluciones de la hormona a concentraciones de, 1%, 2% y 5%.
- Dispensar en los 8 tubos de ensayo el medio de cultivo, 2 tubos para cada dilución y 2 tubos control sin la hormona.
- Sembrar las semillas en todos los medios de cultivo
- Sellar los tubos con los corchos y papel Vinipel.
- Colocar en un lugar donde tengan luz y estén a temperatura ambiente.
- Realizar diluciones de la hormona a concentraciones de, 1%, 2% y 5%.
- Dispensar en los 8 tubos de ensayo el medio de cultivo, 2 tubos para cada dilución y 2 tubos control sin la hormona.
- Sembrar las semillas en todos los medios de cultivo
- Sellar los tubos con los corchos y papel Vinipel.
- Colocar en un lugar donde tengan luz y estén a temperatura ambiente.
Protocolo de desinfección de las Semillas
Como se dijo
anteriormente, con base a los resultados que obtuvimos en los laboratorios que
llevamos a cabo, determinamos iniciar a estandarizar un protocolo de
desinfección para las semillas (Foto 1),
este es el método de la Doble Desinfección (DD).
En la doble
desinfección (DD), el total de las semillas se sumergieron durante 1 minuto en etanol 70 % y luego se probaron 2
concentraciones de NaClO (1.2% y 0.8% de cloro
activo) con 2 tiempos de exposición
de las semillas (30 y 15 minutos,
respectivamente). A la combinación de mayor concentración de NaClO y tiempo se
la denominó “Desinfección Fuerte” (DF), a la otra se la llamó “Desinfección Suave”
(DS). Luego, en ambos casos, las semillas se enjuagaron tres veces con agua
estéril y se dejaron en el agua del último enjuague durante toda la noche para
su imbibición.
Al día siguiente se realizó
la segunda desinfección con NaClO (0.8% de cloro activo) durante 20 minutos
para la desinfección fuerte y 15 minutos para la desinfección suave, seguido
por tres enjuagues con agua destilada estéril.
Foto 1.
Protocolo de desinfección de
las semillas.
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